Beispiel für eine Proteinidentifikation




Proteingemische (z.B. Gesamtzellextrakte) )werden zunächst in einer Polyacrylamid Gelelektrophorese aufgetrennt und der Bereich, der die zu untersuchenden Proteine enthält, ausgeschnitten. Die Proteine im Gelstückchen werden entfärbt, die Cyteinbrücken reduziert (DTT) und durch Iodacetamid dauerhaft inaktiviert. Anschließend werden die Proteine proteolytisch verdaut. Die entstandenen Peptide werden chromatografisch (HPLC) getrennt und gleichzeitig miitels UV detektiert und in die entsprechenden Massenspektrometern injiziert (Elektrospray Ionisation = ESI) Nun werden zunächst die Molekulargewichte der einzelnen Peptide massenspektrometrisch bestimmt. Nach bestimmten Kriterien werden solche selektioniert, die erfolgversprechend für die weitere Identifikation erscheinen. Jedes ausgewählte Peptid wird durch verschiedenen massenspektrometische Methoden (CID, ETD oder HCD) fragmentiert und die Molekulargewichte der entstehenden Fragmente bestimmt (=MSMS Daten). In den MSMS Fragmentmustern kann die Aminosäuresequenz der Peptide durch Abstandsmessungen und Vergleich mit den Molekulargewichten der einzelnen Aminosäuren bestimmt werden. Für einen automatisierte Auswertung werden die MS-Datensätze entsprechend der Retentionszeit, der Masse des Peptids und der Massen der Fragmente sortiert und geordnet. Die sortierten Daten können in verschiedenen Programmen importiert werden, die die Sequenzierung des gesamten Datensatzes übernehmen. Voraussetzung ist , dass die Sequenz des gesuchten Proteins sich in einer Datenbank befindet. Dabei werden die gemessenen Fragmentdaten mit den theoretischen Fragmentierungsmustern aller Peptide, die aus einer Datenbank entnommen werden, verglichen. Alle identifizierten Peptidsequenzen werden dann den entsprechenden Proteinen zugeordet und die Sequenzabdeckung errechnet.

Am Schluß entsteht dann eine Liste aller Proteine, die in der ursprünglichenProbe enthalten war.