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komplexes Proteingemisch
gereinigtes Protein in Loesung
Proteine im Gel
kleine Proteine
Proteine im Gewebeschnitt
geloeste niedermolekulare Substanzen
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Chromatografierte kleine Substanzen

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Proteolyse hydrophiler Proteine
Proteolyse hydrophober Proteine

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HPLC
manuelles Spotten
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Protein-Identifikation

Nachweis nicht kovalenter Komplexe

terminale Sequenzierung

Gesamtnachweis PTMs

Lokalisierung von PTMs

Interne Sequenzierung

Ortsspezifische Massenverteilung

Identifikation und Struktur

ACHTUNG

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ACHTUNG

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Denn sonst geht es nicht weiter......

komplexes Proteingemisch

Proteine beliebiger Anzahl liegen als Gemisch in Lsung vor


Proteine im Gel

Die Proteine wurden in einer SDS-Page (Bitte Kontaminationshinweise beachten !!) separiert und angefrbt.


kleine Proteine

Kleine Proteine oder grosse Peptide (bis max 30 kDal) in Lsung


Proteine im Gewebeschnitt

Proteine oder auch niedermolekulare Substanzen liegen in einem Gewebeschnitt (Gefrierschnitt) vor


geloeste niedermolekulare Substanzen

Niedermolekuare Substanzen, z.B. aus einer chemischen Synthese, Metabolite oder aus Derivatisierungen mssen in organischen Lsungsmitteln (bevorzugt Acetonitril) mit einem Wasseranteil bei sehr hohem (+ NH4) oder sehr niedrigem (+ Ameisensure) pH gelst sein.


Gemische niedermolekularer Substanzen

Niedermolekulare Substanzen liegen als Gemisch in Lsung vor.


Chromatografierte kleine Substanzen

Niedermolekuare Substanzen, wie z.B. Metabolite, Antibiotika, Zucker oder Aminosuren) knnen nach einer Dnnschichtchromatographie direkt auf einer solchen DC-Platte massenspektrometrisch vermessen werden.
Dazu wird die Platte mit Matrix besprht und der Laser des Maldi-TOFs fhrt die Platte dann ab.


ESI-CID-Ionenfalle

Die Ionisierung der Probe wird durch ein Versprhen der Probe (sie muss also gelst vorliegen) bei hohem oder niedrigem pH-Wert erreicht.
Die Ionen werden focusiert und in einer sprischen Ionenfalle mittels Resonanzschwingen auf ihre Massen anaylsiert.
Ein Fragmentierungschritt der Ionen, der zur bestimmung der Struktur oder der Aminosureseqenz dient, wird durch Kollision mit einem Inertgas realisiert (Collision Induced Dissoziation)


ESI-ETD-Ionenfalle

Die Ionisierung der Probe wird durch ein Versprhen der Probe (sie muss also gelst vorliegen) bei hohem oder niedrigem pH-Wert erreicht.
Die Ionen werden focusiert und in einer sprischen Ionenfalle mittels Resonanzschwingen auf ihre Massen anaylsiert.
Die Fragmentierung durch ein neues Verfahren, bei dem 'nur' das Peptidrckgrad spezifisch fragmentiert (ETD = Electron Transfer Dissociation via Flouranthen).
Die Ladungszahl wird anschlieend per PTR (Proton transfer reaction) reduziert und die Ionen knnen dann mittels Ionefalle bei mssiger Auflsung und Genauigkeit detektiert werden.
Posttranslationale Modifikationen verbleiben an den Aminosuren und knnen so nachgewiesen werden.


Literatur zu ETD

Maldi-TOF

Ionisierung erfolgt mittels Laserstrahl von einer Stahlplatte, auf der sich die Probe befindet.
Die Ionen (und auch Fragment-Ionen, erzeugt durch Kollisionen) werden mit einer extremen Auflsung und Massengenauigkeit durch die Analyse der Flugzeit in einem Flugrohr bestimmt.
Die Proben liegen also "offline" vor, knnen mehrmals gemessen werden.
Vorteil zu online-Systemen ist die enorme Geschwindigkiet (tryptischer Verdau eines Proteins kann in weniger als 5 min analysiert werden) und die extreme Messgenauigkeit.


Proteolyse Mikrowelle

Mittels Mikrowelle kann die Aktivitt von Trypsin deutlich gesteigert werden (siehe Tabelle und unten stehender Link).
Wichtig hierbei ist nur, das die Cups, die in die Mikrowelle kommen, gut verschlossen sind, sonst ist hinterher alles weg......


Details zur Methode

manuelles Spotten

Die Probe muss zusammen mit einer sogenannten Maldi-Matrix (s.u.) auf ein Maldi-Target (im Normalfall eine standardisierte Metallplatte) aufgetragen werden. Diese wird anschlieend unter Vakuum ins MS-Gert eingeschleust.
Die Ionisierung der Substanzen erfolgt im Falle von Maldi durch Beschuss eines Lasers auf die energiebertragende Matrix (hin zur Probe).
Die Wahl dieser Matrix ist von der Art der Probe abhngig.
Normalerweise wird die Probe vor dem Auftrpfeln (= Spotten) mit der Matrix in unterschiedlichen Zusammensetzungen gemischt. Eine Mischung kann aber auch direkt auf der Platte erfolgen. Aufgrund des Wasserunlslichkeit der Matrix kann die Probe anschlieend mit Wasser "gewaschen" werden.


Sprayen

Um die Substanzen in einem Gewebeschnitt (Proteine. Peptide, Lipide, Metabolite) oder auf einer DC-Platte zugnglich fr eine MS-Analyse per Maldi-TOF zu machen, mssen sie mit Martix berschichtet werden. Dies geschieht durch Versprhen der Matrix und deren anschlieenden Kristallisation.


Wahl der Matrix

terminale Sequenzierung

Mit Hilfe eines speziellen Fragmentierungsverfahrens (In-Source oder auch Post-Source-Decay) knnen ganze Proteine gezielt fragmentiert werden, sodass ihre C- oder/und N-terminalen Aminosuren entstehen.
Diese knnen dann bestimmt und die Sequenz des Proteins partiell ermittelt werden.
Dieses Verfahren wird auch als "T3-Sequenzing" oder "Top-Down-Sequenzing" bezeichnet.


Gesamtnachweis PTMs

Posttranslationalle Modifikationen lassen sich auch als Massendifferenz von modifizierten zu unverndertem Protein nachweisen. Eine Lokalisierung auf einzelne Aminosuren ist nicht mglich.
Die entsprechende Methodik entspricht deshalb der dem Nachweis des Molekulargewichts ganzer Proteine.


Liste aller Massenshifts

Lokalisierung von PTMs

Aminosure-genaue Lokaliserung von Post-Translationallen-Modifikationen.
Notwendig hierzu ist eine Reduzierung der Proteine auf ihre Peptide und eine effiziente Fragmentierung dieser Peptide.
Diese Fragmentierung erfolgt im Massenspektrometer per CID oder ETD (siehe dort).
Aus den erhaltenen Fragmentmustern kann dann die Modifikation auf die Aminosure genau lokalisiert werden.


Interne Sequenzierung

Bestimmung der Aminosuresequenz des Ausgangsmaterials ohne dieses zerkleinern (gezielte Proteolyse)zu mssen


Ortsspezifische Massenverteilung

Die Massen von Interesse (z.B. von Peptiden, Lipiden oder auch niedermolekularen Metaboliten) knnen ortsaufgelst bestimmt und ihre Menge einer Aufnahme des "Tagets" (z.B. Gewebeschnitt, Dnnschichtchromatografie-Platte) zugeordnet werden.


Literatur zu Maldi-Imaging

Identifikation und Struktur

Durch exakte Massensbestimmung und/oder Fragmentierung knnen Rckschlsse auf die chemische Struktur gezogen werden.